一、實驗原理
超氧化物皮化酶(superoxide dismutase, SOD) 在生物體內廣泛分布, 能伴化超氧陰離子自由基(O2-.)發生歧化反應,從而清除氧自由基,越到防御氧毒、抗輻射+抗衰老等作用·
目前因SOD來源不同測活方法非常多, 但是所測酹活結果相差較大丶活性單位也不統一。因此, 本方法是針對植物型SOD對腎上腺素自氧化法的各種影響因素進行了研究, 建立一種微量、快速、穩定重復性好且適用于植物來源的SOD測定方法·
因植物來源的SOD成分比較復雜, 且有微量的多耐擾氧化物成分。腎上腺素是多耐衍生物, 在堿性條件下會自動氧化, 其中涉及到(O 2-.) 的碰式反應, 可被SOD抑制, 腎上腺素經多步轉化為腎上腺素紅·上腺素紅有480nm和320nm兩個吸收峰-325nm處的吸收更能靈敏地反映自氧化程度·當pH z 10.2, 線性范圍縮短, pH值越高線性范圍越小;pH<10.2時吸光度值極小,易帶入誤差pH10.2維持著良好的線性段,而且斜率適中,可作為實際應用中的適pH·溫度在30℃左右,線性關系較好·著腎上腺素濃度的增加,自氧化速率增大, 線性范圍增加, 當腎上腺素液度為0.4mmol/L使每1min自氧化速率達0.070.提高了靈敏度、減少了誤差。
二、實驗材料及用具
1、實驗試劑
植物SOD樣品(申葉松香草提取) lg pH 7.5質量液度0.05mol/L的磷酸鈉綴沖液、兩雨*0.4mmol/L腎上腺素溶液+50mmol/LpH為10.2的Na2CO 3-NaHC 03緩沖液內含1*10-4M乙二胺四乙酸二鈉雙蒸水+100mmol/L鹽酸液, 內含1*10-4M乙二胺四乙酸二鈉
2丶實驗器具
試管30m、紫外可見分光光度計、恒溫水浴鍋、PHS·3C精密pH計
三、實驗步驟
1配置溶液:配置pH 7.5質量濃度0.05mol/L的磷酸鈉緩沖液·50mmol/LpH為10.2的Na2CO 3-NaHCO 3緩沖液及0.4mmol/L腎上腺素溶液(62:38) ;
2植物SOD樣液的制備·將植物SOD樣品, 加入pH 7.5質量濃度0.05mol/L的磷酸鈉緩沖液, 于4℃條件下3500轉/min離心15min, 取酵液, 加入-20℃預冷兩酮, 取沉淀物落于少量重蒸水中, pH 7.5、質量淬度25mmol/L的磷酸鈉透析即得酵的粗提液。
3、將配置好的50mmol/LpH為10.2的Na2CO 3-NaHC 03緩沖液放到30℃±0.5℃的恒溫水溶鍋中保溫20min;
5將配置好的溶液分別放到325nm的分光光度計下測其吸光值, 每隔lm in記一次
吸光值,連續讀取14分鐘;(試驗中保持溶液溫度在30oC)
6、繪制時間一OD曲線圖,并分析結果
四、活性測定
腎上晾素法的活力單位定義:30℃時, lml反應液中每分鐘抑制腎上腺素自氧化速率達50%時的酶量為一個活力單位。
酵活性計算公式:
U/mg=(0.070-AA325)x100%xV總/[0.070×50%·V。-VS]
其中:
AA325:反應吸光值變化值;
V總:反應總體積(mL);
VS:加入樣品液的體積;
Va:活力單位定義體積(lmL)
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